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Comment effectuer une transformation de la levure

Publié:2015-02-08Source: général
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Levure, un unicellulaire, organisme eucaryote, est plus complexe et applicable pour les humains que les bactéries, mais pousse plus vite et nécessite moins d'entretien qu'un modèle animal pluricellulaire. Transformation de la levure est une des techniques les plus souvent utilisés dans une levure. Similaire à transformation1 bactérienne, transformation de la levure est une méthode de base de forcer les cellules de levure de prendre un plasmide (un fragment d'ADN circulaire artificielle contenant souvent un gène d'intérêt) et de croître, la production de nombreuses copies du plasmide.

Étapes

1

Avant de commencer votre transformation, vérifiez d'abord que vous avez assez de vos documents, y compris: l'ADN plasmidique, l'ADN simple brin 2, tous les tampons (0,1 M LiOAc et fraîchement fait PEG3), et les médias (extrait de levure-peptone-dextrose-adénine milieux liquides et des plaques avec des milieux sélectifs). Les médias et les plaques liquides auront le plus long à faire si vous êtes dehors.

2

La nuit (ou en fin d'après-midi) avant, faire des cultures liquides de cellules de levure vous serez transformer.

3

Vous devez aussi avoir déjà cellules de levure croissants sur une plaque avec extrait de levure-peptone-adénine-dextrose ou supports similaires.

Travailler près de la flamme, le transfert de 5 ml de levure liquide Extract-Peptone-adénine-Dextrosemedia à un tube de culture avec une pipette sérologique.

Grattez une petite quantité de cellules hors de la plaque avec une pointe de pipette, en faisant attention de ne pas percer le milieu solide.

Abaisser avec précaution la pointe dans le tube, en faisant attention de ne pas toucher aux cellules de la paroi intérieure du tube.

Pipet le liquide de haut en bas jusqu'à ce que vous pouvez voir l'amas de cellules sur la pointe dissoudre.

Couvrir les tubes de manière lâche pour assurer un débit d'oxygène vers les cellules.

Incuber les tubes dans un agitateur pendant une nuit 30⁰C.

Retirez les cultures de l'agitateur 30⁰C de la nuit précédente et fermer hermétiquement les bouchons.

Retirer l'ADN plasmidique et l'ADN simple brin du congélateur (ils sont normalement stockés à -20⁰C). Laisser l'ADN plasmidique à décongeler à température ambiante. Chauffer l'ADN simple brin dans la plaque chaude 95⁰C. La solution doit devenir très chaud (presque bouillante) par le temps ADN simple brin est utilisé dans la procédure.

4

Levure Transformation: Maintenant, vous devriez être enfin prêt à commencer la procédure.

5

Durée estimée: 2 heures minimum.

6

Définir une plaque chaude pour 95⁰C (peut être comprise entre 90⁰ et 97⁰) et un autre pour 30⁰C.

7

Allumez le brûleur Bunsen, et souvenez-vous de travailler au plus près de la flamme que possible.

8

Tubes Eppendorf propres d'étiquetage. Les tubes sont normalement marquées avec le contenu (plasmide transformé), la date et les initiales de scientifiques.

9

Pipet 600 pi de la culture liquide dans chaque tube Eppendorf.

10

Tubes à centrifuger pendant 2 min à 2000 rpm. Assurez-vous d'équilibrer la centrifugeuse de manière uniforme.

11

Retirer le surnageant par aspiration sous vide, en faisant attention de ne pas aspirer toutes les cellules dans le culot.

12

Re-suspendre le culot dans 300 ul de 0,1 M de tampon LiOAc par la pipette ou vortex rapidement les tubes.

13

Centrifuger à nouveau pendant 1 min à 2000 rpm et aspirer le surnageant.

14

Répétez les étapes 6 et 7 pour vous assurer que tous les médias est lavé hors des cellules.

15

Pipet 600 ul de PEG tampon dans chaque tube. PEG est une substance très visqueuse, donc soyez prudent lors du pipetage. Pipet lentement, en regardant le flux de tampon sur la pointe. Si vous Pipet trop rapidement, il y aura toujours tampon PEG gauche dans le tube.

16

Pipet 5 ul d'ADN plasmidique et 10 pi d'ADN simple brin chaud dans chaque tube.

17

Incuber les tubes sur le 30ᵒ plaque chauffante, allant de 30 minutes à une nuit.

18

Heat Shock les tubes dans un bain d'eau 42ᵒ pendant 15 minutes exactement.

19

Centrifuger les tubes pendant 2 minutes à 3000 tours par minute et sous vide avec soin le surnageant.

20

Re-suspendre le culot dans 100 ul d'eau MQ.

21

Plate chaque échantillon sur une plaque sélective séparée. Gare à la contamination à cette étape!

Retirer les plaques de la chambre froide, laisser tiédir à température ambiante, et étiqueter chaque.

Utiliser un épandeur de cellule en acier inoxydable stérilisé, d'abord trempé dans de l'éthanol, puis passé à travers la flamme pour évaporer l'éthanol. Laissez l'épandeur cool.

Touchez un coin un coin de l'épandeur sur le bord de la plaque. Si l'épandeur fait une entaille dans les médias, le métal encore trop chaud.

22

Pipeter la suspension de cellules à partir de chaque tube Eppendorf sur la plaque correspondante.

23

Répartir les cellules uniformément avec épandeur stérilisé par la main ou sur une plate-forme tournante.

24

Les plaques sèches autour de la flamme avec des couvertures essentiellement sur, laissant un petit espace ouvert le plus proche de la flamme. Ne pas trop de la plaque laissent ouverte ou la contamination se produiront plus facilement.

25

Dès qu'ils sont secs, couvrir les plaques et les sceller avec du Parafilm.

26

Incuber les plaques dans un incubateur 30⁰. Colonies devraient croître dans 3-7 jours.

Merci pour ton aide! S'il vous plaît nous dire ce que vous savez à propos de

...

Vidéo

Avertissements

De loin, le plus grand obstacle à une transformation de la levure de succès est la contamination. Toute exposition excessive des cellules de levure à l'air libre peut permettre aux bactéries aéroportées de contaminer les cellules. Jours de croissance peuvent aller avant que la contamination est visible (la contamination se manifeste généralement comme des taches floues et décolorées sur les plaques de transformation), de sorte que vous pouvez perdre des jours de travail à un moment chaque fois que votre transformation est contaminée. Lorsque vous travaillez avec des cellules de levure, rester près d'une flamme, en tout temps et de minimiser l'exposition de l'air autant que possible!

Choses que vous devez

Pour les cultures liquides:

Les tubes de culture (un tube sera suffisant pour environ 8 échantillons)

Médias levure liquide Extract-Peptone-adénine-dextrose

Pour la transformation de levure:

Bec Bunsen et l'attaquant

Les cultures liquides

Tubes Eppendorf (un pour chaque échantillon)

Marqueur indélébile pour l'étiquetage

1000 uL pipette et conseils

Tampons: 0,1 M LiOAc, PEG

L'ADN plasmidique

ADN simple brin

Des plaques sélectives

Éthanol

Cellule épandeur

Parafilm

Équipement:

Bec Bunsen et l'attaquant

Centrifugeuse

Vortex

Vide

42⁰ bain d'eau et de support de tubes flottants

Deux plaques chauffantes

30⁰ incubateur

Rotation de la plate-forme de la plaque (facultatif)

[Rédacteur: Admin]
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